一文Vol.18 | 基于蛋白质组学和免疫学方法的蚕丝老化分析研究-中国丝绸博物馆

一文Vol.18 | 基于蛋白质组学和免疫学方法的蚕丝老化分析研究

2021-04-13

丝绸是人类社会发展过程中重要的纺织品材料，拥有巨大的经济价值和文化价值，是古代中华文明的重要载体和象征。近几十年来，随着考古人员的不断探索，越来越多的古代丝织品在中国境内及“丝绸之路”沿线被发现，向后世传达出不同历史阶段重要的政治、经济、科技和文化信息。但随之而来的，就是丝织品的老化和保存问题。作为一种天然大分子，蚕丝容易受到温度、湿度、紫外线、氧气、土壤酸碱度和微生物等因素的影响，从而发生不同程度的老化降解，极大的影响其传世价值和考古学价值。因此，总结丝绸的老化降解规律、掌握丝绸的降解机理，对古代丝绸科学价值认知具有重要意义。

针对这一难题，中国丝绸博物馆周旸团队和浙江理工大学王秉团队合作，采用蛋白质组学和免疫学技术，对大量古代丝织品文物样和人工模拟老化样进行高灵敏性和特异性的定性分析和定量研究。首先，利用LC-MS/MS技术对样品的不同组分进行鉴定，并采用LFQ和iBAQ技术对不同蛋白质的丰度进行定量分析，确定不同组分的降解程度；最后，分别针对丝素蛋白的结晶区和非结晶区制备了特异性抗体，采用Western Blot技术对丝素蛋白不同化学结构的降解情况进行了分析和评估，并提出了丝素蛋白老化降解模型。本研究突破扫描电镜、红外分析等传统方法的限制，从分子和蛋白质水平研究丝绸的降解过程，从而可以更加地准确把握丝绸的老化降解特性和机理。

图1 基于蛋白质组学和免疫学方法的丝绸文物研究示意图

得到以下结论：

（1）通过对碱老化样与文物样进行LC-MS/MS分析，发现在人工老化样品中，检测出的多肽数目呈规律性下降趋势，而文物样中的多肽数目与织物的年代没有一定的联系。对不同丝织品文物样的丝素蛋白中重链、轻链和P25链进程分析，发现重链、轻链和P25链降解速率不同。且除了丝素蛋白的主要成分外，还在样品中检测到丝胶。丝胶是蚕丝蛋白的主要成分之一，附着在丝胶蛋白表面，起着粘连和保护的作用。实验结果表明，无论是古代常用的缫丝和练丝工艺，还是现代工业常用的碱脱胶方法，都无法完全去除丝胶蛋白。但在长久的埋藏或老化过程中，丝胶蛋白可实现完全降解。

（2）采用LFQ定量技术分析同种蛋白质组分在不同样品中的相对丰度，其结果显示重链、轻链和P25的相对丰度随着埋藏时间或老化时间的延长大体上呈现下降趋势，表明所有的组分都发生破坏和降解。部分样品间与时间呈负相关的变化趋势，这表明埋藏环境与降解过程密切相关，其影响甚至可能会大于埋藏时间。值得注意的是，在老化初期，轻链在人工老化样中的相对含量快速上升，而后再逐渐下降，这说明在碱老化过程初期，轻链的降解相对较少。

（3）采用iBAQ定量技术分析单一样品中不同蛋白质组分的相对含量，样品中不同组分含量的差异表明，丝织品文物样中不同组分的降解速率各不相同，再次印证其降解行为和埋藏环境相关。相比之下，人工碱老化样中重链、轻链和P25的相对丰度具有明显的时间相关性，且重链的相对含量明显偏低，表明重链的严重降解。

（4）根据蛋白质组学的检测结果，丝素蛋白中的所有组分均发生降解，为进一步研究丝素蛋白中结晶区和非结晶区的降解特征，分别采用针对无定形区的特异性抗体pAb-1和针对结晶区的特异性抗体pAb-2对样品进行免疫学检测，分析其降解过程。结果显示所有的文物样都能成功的与抗体pAb-1和pAb-2结合，观察到免疫条带，说明在不同年代的丝织品中，无定形区和结晶区都有保留。但是，同种抗体对不同样品的结合条带以及同种样品对两种抗体的结合条带都各不相同。该结果表明不同文物样品中无定形区和结晶区都发生降解，但降解程度不同。

图2 丝素蛋白的降解模型

首先破坏晶体中的非晶区域和相对松散的嵌段，导致晶体区域中紧密的β-折叠片段暴露并劣化。然后，所有区域一起退化。

因此我们推测了丝素蛋白的降解模型（图2）来解释丝织品的降解行为。晶体区域分布在无序的无定形基体中，并沿纤维轴方向定向分布。考虑到H链中不规则的氨基酸序列，结晶区域由紧密的β-折叠片段和相对疏松的片段组成，这些片段包含较少有序的β-折叠以及其他构象。在降解的初始阶段，主要破坏了非晶区和结晶区中相对较松的区域，并且大分子链随机断裂。随着降解的进行，结晶区域中紧密的β-片状暴露并劣化，导致高度有序的结构转变为较松散的结构，这可能解释了有些丝织品文物纤维表观剥离，断裂和塌陷的现象。最后，紧密的β-折叠片段和相对宽松的片段以及无定形区域被进一步破坏并降解成小的多肽。

作为一种天然大分子蛋白质，丝素蛋白极易受到外界环境的影响，且丝素蛋白拥有复杂的多级结构，每层结构的变化都会导致蛋白质的变性或降解。因此，在千百年的保存过程中，降解是既复杂又无法避免的行为。对于不同方法制备的人工老化样来说，老化时间越长，丝素蛋白降解越严重，但根据丝织品文物样的表面形貌、蛋白质组学和免疫学分析结果可知，丝素蛋白的降解不仅受埋藏时间的影响，还与埋藏环境密切相关。