一文Vol.17｜基于电化学免疫传感器的丝绸文物超灵敏检测-中国丝绸博物馆

一文Vol.17｜基于电化学免疫传感器的丝绸文物超灵敏检测

2021-03-27

丝绸之路是古代东西方商贸往来的主要通道，精美的丝绸通过国际贸易被出口至欧亚非大陆的多个国家。然而，由于其生物大分子的特性，蚕丝极易受到外界环境的影响而发生降解。如何对土样中含量极低的丝素蛋白进行检测，成为研究人员面临的一大挑战。

针对上述难题，研究团队通过材料学、考古学、电化学和免疫学等多学科交叉，构建了基于金纳米颗粒与单克隆抗体的电化学免疫传感器，对不同来源、不同种属、不同保存状态的古代丝织品文物进行了定性检测和定量分析。

研究团队设计、制备了可对丝蛋白进行特异性识别的单克隆抗体，合成了形貌、尺寸较为均一的金纳米颗粒，通过层层自组装的方法构建基于抗体和金纳米颗粒的新型电化学免疫传感器；在此基础上优化了实验参数，研究该免疫传感器的灵敏性、特异性、重现性和稳定性；通过电化学免疫传感器对丝素蛋白的检测，测得该方法的最低检出限为3.8 pg/mL，这是截止目前世界上公开报道的丝素蛋白最高检测精度；进而建立了基于电化学免疫传感器的丝绸文物检测体系，以期解决古代丝绸的种属精准识别、溯源和传播路径等问题。

丝绸之路包括草原丝绸之路、沙漠丝绸之路和海上丝绸之路。在过去数十年中，草原丝绸之路和沙漠丝绸之路沿线出土的丝织品文物越来越多；然而，在海上丝绸之路的古代商贸航线范围内，几乎没有发现任何丝织品文物实物，这就为研究海上丝绸之路的形成与发展带来了巨大挑战。证明海上丝绸之路存在丝织品，对了解中世纪东西方跨海贸易模式具有重要意义。2007年，在广东近海海域，一艘南宋时期的沉船“南海一号”被打捞出水，船舱内发现疑似含有丝绸微痕迹的土壤样，利用构建的金纳米颗粒的电化学免疫传感器对这些土壤样进行深层次的分析鉴定研究。

基于金纳米颗粒的电化学免疫传感器的自组装过程

采用层层自组装的方法构建电化学免疫传感器。首先，沿着8字形将玻碳电极 (φ= 3 mm) 在麂皮上用20 nm氧化铝悬浮浆打磨10分钟，然后分别用无水乙醇和去离子水超声波清洗5分钟。接着，用循环伏安法表征电极以确定其表面的洁净程度，在确保电极表面已被彻底打磨清洗干净后，可开始自组装的过程。

首先，在玻碳电极表面滴加4 μL金纳米颗粒溶液，置于37℃恒温烘箱中干燥2小时，烘干后彻底清洗电极三次。随后，将20 μL的0.25 M 3-巯基丙酸溶液滴加到电极表面，使金纳米颗粒与MPA的巯基间形成金硫键，恒温孵育1小时后彻底冲洗。接着滴加20 μL的MES/EDC/NHS (0.1 M/0.05 M/0.03 M) 溶液于电极表面，在37℃恒温烘箱中孵育1小时，此时巯基丙酸的羧基端被活化。接下来, 10 μL的单克隆抗体HAPK0111 (1.36 mg mL-1) 被滴加到电极表面，并在37°C恒温烘箱中孵育60分钟，在此过程中,抗体的氨基与3-巯基丙酸被活化的端羧基结合，使抗体被共价固定在免疫传感器的表面。最后，用去离子水彻底洗涤电化学免疫传感器3次，将电极浸没在0.2% 的BSA中 30分钟，对其表面未吸附的蛋白位点进行封闭，以降低非特异性结合水平。基于金纳米颗粒的电化学免疫传感器的构建过程如图1所示。

图1 基于金纳米颗粒的电化学免疫传感器的自组装过程示意图

电化学免疫传感器的灵敏性检测

为评价电化学免疫传感器的灵敏性，丝素蛋白溶液分别被梯度稀释至0.01 ng mL-1，0.1 ng mL-1，1 ng mL-1，10 ng mL-1 和100 ng mL-1。图2A展示了不同浓度丝素蛋白溶液的DPV响应值，随着样品浓度的增加，DPV峰值呈现下降的趋势。此结果说明，被免疫传感器表面抗体捕获的丝素蛋白越来越多，导致铁离子/亚铁离子这一对氧化还原探针与金电极表面的电子传输效率受到抑制；也证明本实验构建的电化学免疫传感器可对不同浓度的丝素蛋白溶液做出不同响应。此外，DPV峰值与样品溶液浓度的对数值呈现出良好的线性关系，如图2B所示，回归方程为y = - 1.991 Log C + 24.712 (R2 = 0.9946) (y为DPV峰值，Log C为丝素蛋白溶液的对数浓度)，计算可得电化学免疫传感器的最低检出限为3.8 pg mL-1。

为进一步显示电化学免疫传感器的优越性，基于同一单克隆抗体的间接ELISA被构建并用于检测丝素蛋白的检测。如图3A所示，随着丝素蛋白溶液的浓度从1 ng mL-1 缓慢增长至1000 ng mL-1，吸光度的值呈现出一个“S”型的增长趋势。同时，当丝素蛋白溶液的浓度在10-100 ng mL-1这个范围内时，OD值和样品浓度展现出一个明显并且良好的线性关系。如图3B所示，将该区域经过线性拟合得到的回归方程是y = 0.0161 x + 0.0471 C (R2 = 0.9926)，同时计算得出间接ELISA的最低检出限 (S/N = 3) 为11.4 ng mL-1。与传统的免疫学方法相比，免疫传感器展现出更宽的线性检测范围 (0.01 ng mL-1 - 100 ng mL-1) 和更低的检测下限。电化学免疫传感器更优越的性能可能由于以下原因：金纳米颗粒在电极表面的负载使免疫传感器的电化学信号得到增强；抗体通过共价固定在电极表面以形成生物敏感层，抗原通过特异性免疫识别被该层捕获，抗体-抗原的免疫复合物一旦形成，电极表面性质即会发生改变，DPV法直接监测电信号的变化，提高了免疫传感器的灵敏度。

图2 电化学免疫传感器对丝素蛋白的测试结果。(A)不同浓度丝素蛋白的DPV曲线；(B) 不同浓度丝素蛋白的校准曲线

图3 间接ELISA法对丝素蛋白的测试结果。(A) 不同浓度蚕丝蛋白的标准曲线；(B)不同浓度丝素蛋白的校准曲线

南海一号样品的电化学检测

从南海一号船舱的三个不同样品坑1#、3#、8# 内提取了土样，并稀释至1μg mL-1，利用免疫传感器进行检测 (图4A)。根据DPV响应值，3#，8# 样品显示阴性结果，而1# 则被认为包含丝素微痕迹，证明该土样中丝素蛋白的存在。为确保结果的准确性，利用免疫传感器检测被稀释至各种浓度的样品1# (1μg mL-1、0.5μg mL-1、0.1μg mL-1、0.05μg mL-1和0.01μg mL-1)，所得到的结果均显示阳性 (图4B)，DPV响应随样品浓度的降低呈现下降趋势。此外,根据线性回归方程,计算得到各浓度下样品1#中丝素蛋白的含量，分别为0.485% (1μg mL-1)、0.415% (0.5μg mL-1)、0.557% (0.1μg mL-1)、0.514% (0.05μg mL-1) 和0.569% (0.01μg mL-1)，变异系数为12.2%，说明免疫传感器检测结果具有较高的可靠性。综上所述，电化学免疫传感器在古代丝绸样品的定性和定量分析中都表现出了优越的性能。

图4 免疫传感器对南海一号提取土壤样的检测结果。(A)对不同样品坑内土壤样的检测结果；(B) 对1#坑内土壤样的定量分析结果

对海上丝绸之路沿线出土的丝绸微痕迹进行超灵敏检测，对研究海上丝绸之路的形成与发展具有重要意义。基于单抗构建的电化学免疫传感器，与传统免疫学检测手段相比，较大提升了灵敏度与检测下限，特别是在南海一号出土文物样的鉴定中，电化学免疫传感器表现出更优越的性能，证明海上丝绸之路中丝织品的存在。鉴于此方法的普适性，其在整个考古分析领域均具有巨大潜能，可将该免疫传感器应用于其他种属文物的超灵敏检测，以实现微量样品的精确分析。